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新闻速递:BMC兽医学专业期刊发表东纳生物快速荧光定量平台检测犬细小病毒新成果

日期: 2019-03-08
浏览?#38382;? 35

BMC出版社兽医学专业期刊发表

东纳生物快速荧光定量平台检测犬细小病毒新成果

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随着分子生物学的发展,聚合酶链式反应(PCR)技术、等温扩增技术、基因芯片、探针杂交等技术已经广泛应用于微生物检测、感染性和遗传性疾病诊断、基因表达及突变检测等诸多领域的?#33455;俊?#28982;而,检测结果的判断主要依赖于传统的琼脂糖凝胶电泳检测,该方法不但耗时费力,而且由于涉及核酸染料等,安全性问题也有待提高。目?#20843;?#28982;逐渐出现多种核酸检测方法,然而基本受制于昂贵的仪器和试剂成本(如荧光定量PCR)或检测灵敏度不高(比色法、浊度法)等因素?#21335;?#21046;,难以真正普及到基层和?#23548;?#20020;床检验工作?#23567;?/span>

近年来,磁分离已在生物测定的广泛应用,磁性微球(磁珠)成为分子细胞生物学?#33455;俊?#20998;子诊断、免疫诊断及细胞分选中极为重要的工具和核心原材料。MagBeadsTM磁性微球系列是东纳生物的明星产品,其采用经典的核壳结构设计制造,内核为聚合物微球,外层为磁性物质,最外层采用特殊聚合物修饰,具有尺寸分布均一、表面负载量高、极短的磁响应时间、高的分散稳定性等特点,可以快速、高效地从样本中分离出待测物,极大地提高检测效率。目前MagBeadsTM系列磁性微球已广泛应用于核酸提取、DNA捕获与传感技术、PCR产物纯化、测序纯化、核酸转染、抗体纯化、细胞分选、特定蛋白分离、化学发光检测、模拟酶等诸多领域,获得许多知名的大学、?#33455;?#26426;构与临床诊断实验?#24050;芯?#20154;员的广泛好评。

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1MagBeadsTM系列磁性微球

基于东纳生物研发团队在MagBeadsTM系列磁性微球的?#33455;?#22522;础,东南大学生物医学工程学院?#33455;?#20154;员与东纳生物合作开发出一种PCR产物磁珠法纯化联合快速荧光定量检测试剂盒(PCR-LFIA),使用磁珠去除PCR产物中的引物二聚体,使用荧光微球作为荧光信号放大器,确保检测的灵敏度和准确?#21462;?#20351;用配套检测平台Nanoeasy 1700,可快速实现检测结果数字化定量。?#27308;?#21058;?#24615;?#20445;持PCR特异性的基础上,灵敏度?#26432;?#26222;通PCR2~3个数量级,与荧光定量PCR相?#20445;?#19988;不涉及有毒试?#31890;?#20202;器简便、?#23376;?#25658;带,通过互联网可实时共享测试结果。PCR-LFIA检测法快速,灵敏,特异且安全,在疾病诊断、食品检验和环境微生物监测方面具有广泛的应用潜力,尤其适合即时诊断(POCT)应用。

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2:快速荧光定量检测平台Nanoeasy 1700和系列试剂盒

犬细小病毒(Canine?parvovirus)感染又称病毒性肠炎、传染性肠炎,它是一种接触性、急性、高致死性的传染病。该病多?#23454;?#26041;性流行,发病?#39280;?/span>60%~100%,无明显的季节性。犬细小病毒病由于其高传染性、高发病率、高死亡率,且容易误诊而错过最佳的治疗时间,从而给养犬业、宠物及一些野生动物的饲养带来了重大损失。目前实验?#39029;?#29992;的诊断方法主要包括电镜与免疫电镜(IEM)、病毒的分离鉴定(VI)、血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)、胶乳凝集试验(LA)、间?#29992;?#30123;荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫层析试验(ICA)、PCR法(包括普通PCR和和实时荧光PCR)等。上述方法都有各自的优点和不足。电镜和免疫电镜技术需昂贵的仪器设备和丰富的观察经验。病毒分离培养费时费力,实验条件严苛且成本?#32454;摺?#24212;用较广泛的HAHI法,需随时准备新鲜的敏感红细胞,且对粪便样品容易误诊。ELISAICA法能实现病毒的快速检测,但其敏感性和准确度都有待提高。PCR诊断方法灵敏度高、特异性强,并且能够在病毒感染的早期快速检测。但PCR法需要通过凝胶电泳设备(时间长、涉及有毒试?#31890;?#25110;荧光定量设备(试剂、仪器昂贵)。

有鉴于此,项目组?#33455;?#20154;员以犬细小病毒(CPV-2)为检测对象,优化出LFIA的最佳工作反应体系(100 μL)和反应时间(2 min)。结果显示,PCR-LFIA法仅检测到CPV-2,非CPV毒株均显示阴性。检测灵敏度为30 copies/μL,并且与常规PCR在临床样?#20998;?#30340;检测结果一致(22.6%阳性,14/62),Cut-off值为146。检测结果通过Sanger测序和BLAST进一步验证。从PCR步骤开始整个过?#25506;?#38656;约80分钟。

?#33455;?#25104;果发表在BioMedCentral出版社专业兽医学?#33455;?#26399;刊BMC Vet Res2019, 15: 30),相关成果已经申请国家发明专利。

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3PCR产物磁珠法纯化联合快速荧光定量检测试剂盒(PCR-LFIA)?#33455;?#31034;意图

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4LFIA的工作反应体系和反应时间优化结果图. aLFIA的工作反应体系优化(荧光成像图);bLFIA的反应时间优化(荧光成像图);cLFIA的工作反应体系优化(Nanoeasy 1700);dLFIA的反应时间优化(Nanoeasy 1700

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5PCR-LFIA检测CPV-2方法的建立. aPCR产物纯化试剂?#24615;?/span>CPV-2扩增产物上的应用结果;b,快速荧光定量检测平台测试PCR产物纯化结果

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6PCR-LFIA检测CPV-2方法的特异性测试. aPCR结果使用琼脂糖凝胶电泳验证;b,快速荧光定量检测平台验证PCR结果

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7PCR-LFIA检测CPV-2方法的灵敏度测试. aPCR结果使用琼脂糖凝胶电泳验证;b,快速荧光定量检测平台验证PCR结果;c,快速荧光定量检测结果标准曲线

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8PCR-LFIA法检测宠物犬粪便样品结果

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